1190, la troisième croisade fait rage sur la Terre sainte. Les Croisés se battent contre les Sarrasins pour le contrôle de Jérusalem, la Ville Sainte.  

Un jeune assassin( Horacio Altman) revient chez lui après un dur voyage et est chargé par ses aînés de trouver et rapporter un objet sacré : le Calice. Ce trésor aurait le pouvoir d’unir sous un même drapeau toutes les factions. Quiconque le posséderait, que ce soit les Croisés ou les Sarrasins, pourrait ainsi mettre un terme à la troisième croisade par la victoire d’un des deux camps. Mais le Calice est un objet bien trop puissant pour être laissé entre les mains des hommes : il doit être trouvé et détruit.  

L’assassin, Altaïr( Horacio Altman), commence alors son voyage. À Damas, un assassin, Rafik, lui apprend qu’un marchand, Tamir, le chef des sarrasins, est en relation avec les Templiers. Altaïr interroge Misbah, un homme en connexion avec Tamir. Ainsi, il peut retrouver ce dernier. Il apprend, avant de le tuer, que le Calice est gardé dans le Temple du Sable et qu’il a besoin de trois clefs pour y entrer. Il obtient la première auprès de Tamir. Altaïr rend ensuite visite à une danseuse de cirque, Fajera( Margot Nicotero). Celle-ci semble détenir des renseignements cruciaux mais elle s'enfuit. Une fois celle-ci rattrapée, Altaïr( Horacio Altman) doit tuer un Templier du nom d’Alaat qui la protège. Ce n'est qu'ensuite que la danseuse( Margot Nicotero) lui apprend que la seconde clef se trouve dans l’hôpital des Templiers à Tyr.  

Il parle alors à un confrère assassin de Tyr, Hamid, et apprend que Roland Napule, à la tête de l’hôpital, possède probablement la clef. Après avoir traversé les égouts, Altaïr( Horacio Altman) assassine Roland et récupère la clef auprès d’un prisonnier subissant un interrogatoire. Il voyage alors vers Jérusalem et parle avec Kadar qui lui apprend que le chef des Templiers, Basilisk, est dans le palais royal de la Ville Sainte et qu’il possède la troisième clef. Après avoir infiltré le palais avec l’aide de l’un des hommes de Kadar, Altaïr( Horacio Altman) combat Basilisk et lui prend la clef.  

Mais, à son retour à Tyr, les Templiers attaquent Hamid et volent la carte du Temple du Sable. Altaïr les prend alors en chasse jusqu’à leur tour et, après avoir atteint le haut de celle-ci, tue le maître de la tour pour lui reprendre la carte. L’assassin part alors pour le Temple du Sable et se fraie un passage jusqu’à la salle du trésor. Mais, il n'y trouve qu'un coffre vide et Basilisk qui lui rit au nez. Après avoir échappé à l’effondrement du temple, Altaïr repart pour Tyr.  

Hamid lui explique comment infiltrer le château où se trouve Basilisk. Altaïr part le combattre et le blesse gravement. Son adversaire lui révèle alors que le Calice est en fait une femme de Jérusalem nommée Adha et que les Templiers sont en train d’assiéger la ville de Saint-Jean-d’Acre, sur la route de la Ville Sainte. Altaïr y part, infiltre le camp des Templiers et y tue le commandant. Il se rend ensuite à Jérusalem où il sauve Adha et apprend que les Templiers ont acheté le commandant en second des assassins, Harash. Altaïr va donc à Alep, dans la forteresse des assassins, pour tuer Harash. À ce moment, Basilisk capture Adha et l’emmène au port de Jérusalem. Altaïr parvient à les rattraper et tue Basilisk sur son bateau. Mais, Adha est sur un autre bateau qui fuit avant qu’Altaïr ne puisse l’atteindre. Finalement, contraint d’abandonner la poursuite, le jeune assassin se fait le serment qu’il retrouvera Adha.